next generation sequencing

• yeni nesil dizileme diyelim, guzel turkcemize bu teknolojiyi de kazandirmis olalim ki tartisabilelim ogrenebilelim --uretmesek de.
  
  oncelikle (bkz: dna dizi analizi)
  
  son yillarda, ozellikle insan genom projesinin bitirilmesinin ardindan, sanger kimyasinin otesinde, daha hizli, daha yuksek coverage destekleyen dizi analizi teknolojileri buyuk bir patlayis icerisinde. bircok irili ufakli sirketin, bambaska yollar kullanarak ayni hedefe ulasmaya calisan cesitli urunleri bugun kullanilabilmekte, daha fazlasinin da eli kulaginda, bekliyoruz. iste bu teknolojilere topluca next generation sequencing deniyor. dedigim gibi hepsi birbirinden cok farkli oldugundan dolayi "ozellikleri sunlardir" diyerek ozetlemek cok zor, o yuzden birer birer teknolojileri ele alip, nasil calistiklarini (aciklanmislarsa tabii) ele almamiz en sagliklisi.
  
  1) solexa
  sistemin adi: the illumina genome analyzer
  
  illumina adli sirket tarafindan pazarlanan bu dizi analizcisi ngs teknolojisinin ilklerinden ve buyuk ihtimalle an itibariyle en populer olani. daha da populerlesecek olmasinin en onemli sebebi ebi ve sanger instituteun bunlardan bir suru kullaniyor olmasi. soyle calisiyor:
  dna'nizi aliyorsunuz, iki ucuna iki tag takiyorsunuz, bunlari solexanin propriety ciplerine koyuyorsunuz, bridging dedikleri bir yontemle bunlar cogaltilip clusterlar haline getiriliyor. bu asamada elinizde milyarlarca farkli cluster chip'in uzerinde bekliyor. bundan sonra asil sov basliyor: eklediginiz tage karsi bir primer, polimerazla birlikte ortama saliniyor, daha sonra floresan isaretli nukleotidler, flow celllerin icine tek tek, sirayla birakiliyor ve her dongu sonrasinda floresan isaretleri yok edilip bir sonraki donguye hazirlaniyorlar. bu sirada tepede super hassas bir alici, clusterlari tek tek takip ediyor ve sinyalleri kaydediyor. sonucta elinizde her nukleotid birakiminda bir resim oluyor ve bu resimde bir suru farkli renkte noktaciklar bulunuyor. sirayla, bu resimleri arka arkaya dizdiginizde, renkleri takip ederek her cluster icin bir dizi elde ediyorsunuz, sonra bir bilgisayar butun bu veriyi birlestirip "iste budur" diyor.
  evet, karisik, cok iyi nanoteknoloji, photonics ve biyoinformatik gerektiriyor ama cok guzel calisiyor. en buyuk dezavantaji her readin, teknik nedenlerden dolayi sanger metodundaki gibi 700-1000 baz degil de 25 baz kadar olmasi. ama iste elinizde akil almaz derecede fazla veri oldugundan dolayi bu 25'leri assemble edebiliyorsunuz. bir de su var ki bu okunabilen maksimum baz sayisi de surekli artiyor, bu aralar 75 baz'a kadar okuyabiliyoruz diyorlar, yakin zamanda bunun 100'un uzerine cikacagini bize ebi'da bizzat soylemislerdi. zaten simdi illumina web sayfasina girecek olursaniz her tarafta long reads yazdigini goreceksiniz, farkindalar zayif noktalarinin
  
  2) 454
  sistemin adi: the genome sequencer flx
  
  arkasinda roche gibi bir dev olan 454 alaninin ilk ornegi. soyle calisiyor: dna'nizin yine cift tarafli tagleniyor. bu tagler yardimiyla her dna parcasi tek bir beade baglaniyor ve bu beadler emulsion pcra tabi tutuluyor; boylece her bead uzerinde tek bir dna turu cogaltilmis oluyor. daha sonra bu beadler uzerinde cok kucuk, tek bir beadin sigacagi kuyucuklerin oldugu bir ortama birakiliyorlar. bu sistemle floresan isaretli nukleotidler yok; standart nukleotidler yine sirayla polimeraz ve primerle beraber ortama saliniyorlar ve polimeraz dogru nukletid geldikce sentezini surduruyor. burada yine super hassas alicilarin aldigi sinyal cok garip: surekli ortamda bulunan sulfurylase adli bir enzim, her nukleotid eklendigine ortaya cikan pyrophosphatei aliyor ve yine surekli ortamda bulunan 5-phosophosulfate ile birlestirerek atp olusturuyor. bu atp'yi kullanan ve yine surekli ortamda bulunan luciferase ortama isik saciyor. yani isin ozu eger nukleotid dogru ise ortama isik saciliyor ve alici bunu kaydediyor. yine noktacikli, ama tek renkli resimler arka arkaya dizildiginde her kuyucuktaki dna'nin dizisi anlasilabiliyor. sistemin avantajlari 250-500 baz arasinda readler verebilmesi, ayrica butun deneyin 10 saat kadar surmesi, bu sure diger teknolojilerde 1-7 gun arasinda degisiyor.. dezavantajlari ise solexaya kiyasla coveragein dusuk, maliyetin yuksek olmasi.
  
  3) solid
  sistemin adi: the solid system
  
  applied biosystems tarafindan pazarlanmakta, ki artik invitrogen bunyesindelermis kendileri. acik konusayim bu aletin nasil calistigini sirf yaziyla anlatmak mumkun degil, cok acayip bir yontem kullaniyorlar. bir kere polimeraz yok, ligation ile yapiyorlar yapacaklarini. ayrica ikili kombinasyonlar haline okuyorlar sinyallerini, boylece baz okuma hatalari anormal dusuk. garip bir sistem, ama ucuz ve coveragei yuksek. readler yine kisa, 50 baz civari diyorlar.
  
  4) heliscope
  sistemin adi: helicos genetic analysis system
  
  helicos biosciences tarafindan gelistirilen bu teknoloji bastaki ucluden ayrilmakta, hatta bu ve benzeri sistemlere 3rg generation denmekte simdiden. ilk tsms, yani true single molecular sequencing sistemi kendileri ve bununla bol bol ovunuyorlar. adamlar polimeraz (hangisi bilmiyorum) ve kendi icatlari olan floresan isaretli, eklendikten sonra sentezi durduran (virtual terminator) nukleotidler kullaniyorlar. asiri hassas alicilarla polimerazi takip ediyorlar ve bir baz eklendiginde bunu kaydediyorlar. avantaji uzun readler vermesi, dezavantaji pahali olmasi. ayrica bu sistemin zaten az alicilarindan birinin de aleti iade ettigi bilgisi ortamlarda dolasiyor. yani cok tutmadi bu icat.
  
  5) smrt
  
  pacific biosciencesin ortaya attigi bu sistem henuz satilmiyor, simdilik 2010 diyorlar cikis tarihi icin. fakat bir ilginclik yapip teknolojinin makalesini onceden bastilar. sistem helicos gibi, sadece daha iyi oldugunu soyluyorlar. polimerazlari ozel ve nukleotidleri 3 degil de 6 fosfatli ve floresan isaret son fosfata bagli, yani sentez oldugunda ortama karisip kayboluyor. okuma yaptiklari kuyucuklar simdiye kadar uretilmis en kucuk kuyucuklarmis ve alicilari simdiye kadar yapilmis en hassas aliciymis. inanilmaz uzunlukta readler aldiklarini soyluyorlar, 2000 baz'a kadar cikabiliyormus. helicosu olduren cok hatali okuma isini de dna'lari okumadan once dairesellestirip cok defa okuyarak cozuyorlarmis. isin en heyecan verici yani polimeraz saniyede 10 baz yazdigindan, ve bunlar bunu aninda takip ettiklerinden 5 yil icinde bir calisma dongusunun 3 dakikada bitirebileceklerini iddia ediyorlar; yani daha sonraki analiz suresi sayilmazsa uzun readlerle, cok yuksek coverageli bir insan genomu 3 dakikada bitirilebilecekmis gibi gorunuyor. bekliyoruz.
• (bkz: ion torrent)
• 2 temel method kullanan yeni nesil dna dizilemedir. bu methodlar, sequencing by synthesis ve sequences by ligation olarak adlandırılır. bunlardan en çok tercih edilen sentezleme dizilemedir, ki ıllumina bunu kullanmaktadır.
  
  tek tek açıklamak gerekirse:
  
  1. sentezleme dizileme: belirttiğim gibi en çok tercih edilen yöntemdir. bu teknik de kendi içinde 2 kısma ayrılır; cyclic reversible termination (cnt) ve single nucleotide addition (snt). geri dönüşümlü sonlandırma ve tek nükleotit ekleme olarak çevirdim şu an ben, hatalıysa bilmiyorum.
  
  cnt tekniğini ıllumina ve qaigen makinaları kullanır. bu tekniğin temeli aslında sanger dizilemeye dayanmaktadır. didioxynucleotitler (ddntp) bilindiği üzere 3' hydroxyl grupları yoktur bu da polymerase enzimini durdurmaya sebep olur. aynı zamanda bu ddntpler florasan işaretleyiciye sahip olduğu için, hangi nükleotitin bağlandığını ayırt edebilirsiniz. bu sistemde tüm 4 nükleotiti aynı anda eklenip, bağlanan bir nükleotitten sonra geri kalan dna bazlarını yok edersiniz, ve o bağlanan bazın verdiği sinyali sistem kaydeder. bu olay, tüm dna dizilenene kadar bu şekilde devam eder. çok uzun fragmanlar okunmaya çalışıldığı vakit hata oranı artan bir tekniktir.
  
  snt tekniğini ise 454 pyrosequencing ve ıon torrent makinaları kullanır. pyrosequencing dizileme tekniğinde, okunacak dnanıza her nükletoit eklendikçe enzimatik taşıma dediğimiz sinyal oluşur (enzymatic cascade) ve ortama salınan pyrophosphatelerden faydalanılarak data analizi yapılır . burdaki enzim luciferase enzimidir bu arada. bu teknikle uzun dna fragmanları okunabilir.
  ion torrent tekniği ise tıpkı pyrosequencing mantığıyla çalışıyor bir nevi. pyrophosphate yerine, nükleotit birleşmesinden sonra ortama salınan hidrojen iyonları semiconductor tarafından algılanıp sinyal gönderir. tabi bunun için tüm nükleotitlerin ortama ayrı ayrı salınması lazım. adenin varlığında ortama hidrojen iyonu salınıyorsa he ok benim nükleotitim timinmiş diyorsunuz. eğer hidrojen iyonu konsantrasyonu iki veya üç katı ölçerseniz peşpeşe aynı nükleotit olduğunu anlarsınız.
  
  2. bağlama dizileme: bu teknik diğerlerinden oldukça farklı bir tekniktir, çünkü dna polymerase enzimi kullanılmadan yapılır. onun yerine 8-mer oligonükleotit probelar kullanılır. herbir probun 8 tanesinden sadece 2 spesifik bazını biliyorsunuz, ve ortama bıraktığınız her bir probun spesifik rengi var yine. ligase enzimi yardımıyla probunuz dna dizinize hybridize olacaktır. tabi bunun sonucunda sinyal verecek. son 3 baz kesilip, bir diğer probunuz hibrize olacak. ortalama 7 hibridizasyondan sonra dna dizisi denatüre edilerek, başka primer kullanarak bu olayı tekrar ediyorsunuz, fakat bu sefer hibridizasyon bir baz öncesinden başlıyor ve ortadaki boşlukları dolduruyorsunuz. toplamda 5 primer kullanmış oluyorsunuz.
  
  ngs tekniğinin meşhur makineleri ise şu şekildedir:
  ıllumina hiseq, 454 sequencer, solid system (bağlama dizileme yapan makine), ion proton.
  
  şu ana kadar açıkladıklarımı şu video üzerinden izleyebilirsiniz, görsellerle daha anlaşılır olacaktır. izleyebilirsiniz.
  
  şurda ise illumina tekniği çok güzel bir şekilde anlatılmıştır, illumina
  
  şu ana kadar anlatılanlar kısa fragmanları okuyup daha sonra birleştirme mantığıyla çalışan tekniklerdi. burdaki okumaları da doğru düzgün bir şekilde okumak için de şurdaki yazıma bakabilirsiniz. paired end vs mate pair sequencing. eğer diziniz kompleks ve tekrarlayan dizileriniz çoksa bu yöntem sökmeyebilir bu yüzden fragmanlara ayırmadan daha uzun dna dizilerini okumanız lazım.
  
  uzun fragmanları okumak için geliştirilen teknolojiler ise çoğunlukla kullanılanlardan bahsedeceğim sadece: pacific bio ve oxford nanopore teknoloji (ont).
  
  pacbio birçok picolitre hacminde hücrelere sahip. bu hücrelerin herbirine okumak istediğiniz dnalarınızı ekliyorsunuz. burdaki mantık tamamen hibridizasyona dayalı. transparan hücre zemininde polymerase enziminiz var ve her bir nükleotitle hibridize olduğunda işaretlenmiş nükleotitler okunuyor.
  ont'ta ise tüm teknik tamamen farklı. ışık, renk, ph ölçme yerine, elektrik akımından faydalanılıyor. protein porundan elektrik akımı geçerken dna da geçiyor (tek şeritli olarak). belli dna dizisi karakterlerine göre de pordaki voltajda değişim ölçülerek, dizi oluşturuluyor. bu teknolojinin avantajı taşınabilir olmasıdır. eşşek kadar değildir diğer makineler gibi.
  
  bu konu hakkında daha detaylı öğrenmek isteyenler için ise tavsiye ettiğim, benim için dünyanın en açık ve net makalesini paylaşıyorum, kendisi oldukça günceldir [2016 http://www.nature.com/…v17/n6/full/nrg.2016.49.html].
  
  en fazla okuyabildikleri ortalama okuma uzunluklari kiyaslamasi:
  pacbio: 8500 bp
  ıon torrent: 400 bp
  pyrosequencing: 700 bp
  sequencing by synthesis (ıllumina): 300 bp
  sequencing by ligation (solid): 75 bp
  
  edit: daha kapsamlı başlıklar ve açıklamalar eklenmiştir.