şükela:  tümü | bugün
  • zincirleme polimeraz tepkimesi, ilk olarak 1983 yılında, abd’li biyokimyacı kary mullis tarafından geliştirilmiştir. bu öncü çalışmasından ötürü, 1993 yılı nobel kimya ödülü’nü almıştır. zpt, moleküler biyolojide dna’nın veya bir genin küçük bölümlerinin çok sayıda kopyasını yapmak (amplife etmek) için kullanılır. çok küçük miktarda dna parçasından, dna’nın belli bir bölümünün binlerce ya da milyonlarca kopyasını üretmek, zpt kullanılarak mümkün olur.

    zpt, medikal ve biyolojik araştırma laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan bir araçtır. dizilenecek dna’nın işlenmesinin erken aşamalarında, enfeksiyon sırasında patojenleri tanımlamaya yardımcı olması için bir genin varlığını ya da yokluğunu algılamada ve ayrıca adli tıpta küçük dna örneklerinden adli dna profilleri üretmede zpt’den yararlanılır.

    zpt nasıl işliyor?
    dna örneği ne olursa olsun, tüm zincirleme polimeraz tepkimelerinin ardındaki ilkeler aynıdır. zpt kurulumu için 5 temel bileşen gerekir.
    bileşenler şunlardır: kopyalanacak dna şablonu primerler, yani kopyalanmak istenen dna bölümünün her iki yanına bağlanarak, zincirleme polimeraz tepkimesini başlatacak olan kısa dna iplikleri. dna nükleotit bazları (yani dntp’ler). dna bazları (a, c, g ve t), dna’nın yapı taşları olup, yeni dna ipliğini yapılandırmak için gereklidirler. yeni dna bazlarını eklemek için taq polimeraz enzimi. tepkime için doğru koşulları garantilemek amacıyla tampon. zpt’de makine tarafından kontrol edilen ve ısıl döngü adı verilen bir ısıtma ve soğutma süreci sağlanır. üç temel aşama vardır: doğal yapıyı bozma (denatürasyon) – çift iplikli dna şablonu ısıtılarak, iki ayrı ipliğe bölünür. yeniden birleştirme – sıcaklık düşürülerek, dna primerlerinin şablon dna’ya bağlanmasına olanak tanınır. genişletme – sıcaklık yükseltilerek, taq polimeraz enzimi tarafından yeni dna ipliğinin yapılması sağlanır. bu üç evre 20 ilâ 40 kez yinelenerek, her seferinde dna kopyalarının sayısı iki katına çıkarılır. tam bir zpt’nin gerçekleştirilmesi birkaç saat alabilir. bazı yüksek hızlı makinelerle ise 1 saatten az sürede tamamlanabilir. zpt tamamlandıktan sonra, elektroforesis adı verilen bir yöntem sayesinde, üretilen dna bölümlerinin sayısı ve büyüklüğü kontrol edilebilir.

    genome research limited zpt evrelerinde neler olur? doğal yapıyı bozma evresi bu aşama sırasında, dna şablonunu ve diğer tüm bileşenleri içeren karışım, 94-95°c’a ısıtılır. yüksek sıcaklık nedeniyle, şablon dna’nın iki ipliğindeki bazlar arası hidrojen bağları kırılır ve iplikler ayrılır. bunun sonucunda iki ayrı dna ipliği elde edilir ve bunlar yeni dna ipliklerinin üretimi için şablon görevi görürler. dna ipliklerinin birbirlerinden bütünüyle ayrılmasına yetecek süre ile yüksek ısının uygulanmasının sürdürülmesi önemlidir. bu genelde 15-30 saniye alır. yeniden birleştirme evresi bu evrede tepkime 50-65°c’a düşürülür. böylece, primerler tek iplikli şablon dna’da belirli bir yere hidrojen bağı ile tutunabilir (net sıcaklık, kullanılan primerlerin erime sıcaklığına bağlıdır). primerler, uzunlukları 20 ilâ 30 civarında olan tek iplikli dna veya rna dizilimleridir. primerler, kopyalanacak dizilimin her iki ucundaki kısa dna bölümlerine bütünleyici olacak şekilde tasarlanır. primerler, dna sentezi için bir başlangıç noktası görevi görür. polimeraz enzimi, sadece çift iplikli bir dna’ya dna bazlarını ekleyebilir. polimeraz enzimi, ancak primer bağlandıktan sonra tutunabilir ve serbest bazlardan yeni bütünleyici dna ipliğini yapmaya başlayabilir. ayrılan iki dna ipliği birbirlerinin bütünleyicileridir ve yönelimleri terstir (bir uçtan -5 üssü ucundan- diğer uca -3 üssü ucuna-); bu nedenle iki primer vardır: ileri primer ve geri primer. bu adım genellikle 10-30 saniye sürer. genişletme evresi son aşama süresince, ısı 72°c’a çıkarılarak, dna bazlarını ekleyen özel bir taq dna polimeraz enzimi tarafından yeni dna’nın yapılması sağlanır. taq dna polimeraz, ısı-sever bakterilerden olan thermus aquaticus‘tan alınma bir enzimdir. bu bakteri, normalde sıcak su kaynaklarında yaşar ve 80°c üzerindeki sıcaklıklara dayanabilir. bakterinin dna polimerazı, yüksek sıcaklıklarda oldukça kararlıdır (stabildir).

    yani zpt’nin denatürasyon aşamasında dna ipliklerini ayırmak için gereken sıcaklıklara dayanabilir. diğer pek çok organizmadan alınan dna polimerazlar, bu denli yüksek sıcaklıklara dayanamaz. örneğin, insan polimerazları ideal olarak 37°c’ta (vücut sıcaklığında) çalışır. taq polimeraz için en uygun çalışma sıcaklığı ise 72°c’tır. primere tutunur ve ardından 5 üssü yönünden 3 üssü yönüne doğru, tek ipliğe dna bazlarını teker teker ekleyerek bütünleyici ipliği inşa eder. sonuçta ortaya yepyeni bir dna ipliği ve çift iplikli bir dna molekülü çıkar. bu adımın süresi, amplife edilmekte olan dna diziliminin uzunluğuna bağlıdır. genellikle 1.000 dna bazını (1kb) kopyalamak 1 dakika alır. zpt’nin çok sayıda dna kopyasını nasıl ürettiğini gösteren çizim. genome research limited ısıl döngünün bu üç evresi, ilgilenilen dna diziliminin çok sayıda kopyasını üretmek için 20-40 kez yinelenir. zpt sırasında yapılan yeni dna parçaları da dna polimeraz enziminin tutunup, yeni dna yapmaya başlayacağı şablonlar olarak görev yapar. dolayısıyla kısa süre içinde, belli bir dna parçasının çok fazla sayıda kopyası üretilir.