dna sequencing

• dna moleküllerinin nükleotid dizisinin belirlenmesinde halen tercihe dilen metod, zincir sonlandırma metodudur. öncelikle dna parçası, parçanın kodlayan ipliğinin tek iplikli dna olarak izolasyonuna olanak tanıyan bir faj olanm13'e klonlanır. bu daha sonra primer denen ve tek iplikli dna parçasının 3' ucuna bağlanan kısa bir dna parçasına hibridize edilir. bundan sonra deoksiribozonükleozit trifosfatlar (dntp, yani dgtp, datp, dttp, dctp) eklenir ve bir dna polimerazın, kodlayan ipliği kalıp olarak kullanarak ikinci bir ipliğin sentezini katalize etmesi sağlanır. dntp'lere ek olarak, küçük miktarlarda dideoksinükleozit trifosfatlar (ddntp) da eklenir. bir ddntp'nin eklenmesi, ikinci iplik sentezinin sonlanmasına yol açar. karşılık gelen dntp'nin ne zaman katılması gerekirse bu gerçekleşebilir. primere ek olarak 3, 6, 8, 13 veya 18 farklı nükleotidi içeren parçalar oluşturulur. bir dna dizisi elde etmek için, her biri farklı bir ddntp içeren dört ayrı reaksiyon gerçekleştirilmelidir. ürünler daha sonra sentetik bir jel tabakasına yan yana yüklenir ve elektroforez ile ayrılır. alınan yol, zincirin uzunluğu ile ters orantılıdır. dna parçaları görüntülendiğinde, nükleotid dizisi, jelde en alttan başlayıp jelin en üstüne doğru tek şeritlerde parçaların bulunuş sıralarını not ederek direkt okunabilir. optimal şartlar altında, tek bir deneyde yüzlerce nükleotidin dizisini belirlemek mümkündür.
  
  kaynak: jan koolman, klaus-heinrich röhm renkli biyokimya atlası
  dna dizisinin belirlenmesi