dna sequencing

• dna üzerindeki nükleotidlerin tam sırasının bulunması işlemine verilebilecek adlar içinde en güzeli budur. nasıl yapıldığına gelir isek, kolaydır, birçok metodu vardır diyelim önce. dünya üzerinde kulağa karmaşık gelen ne var ise kolaydır mottosunu hatırlatarak kolaylığına tekrar atıfta bulunalım ve itiraf edelim ki, güzel anlatan biri anlattığı sürece kolaydır, ne var ki bu satırların yazarı bu konuda kesinlikle iddiasızdır. yine de bu metodlardan en sevilen, en çok kullanılan dideoksi metodunu ayrı bir başlığa gitmeden hemen burada anlatmak üzere bir girişimde bulunalım, azimli ve dahi meraklı sözlükseverler için.
  
  dideoxy metodu, zincir durdurma metodu olarak da bilinir. (arkadaşlar bunu feci salladım ancak orjinal ismi chain termination method, bunu bilin)
  
  şekil çizebilsek ne kadar kolay olurdu düşüncesine kısa bir süre kanmış olsam da şeklin açıklayıcılığının da kimya bilgisine bağlı olması farklı bir anlatım yolu bulmamızı gerektirmekte. paragraf atlanarak okunmasında sakınca olmayan bir metin ile çözmeye çalışalım bu sorunu.
  
  şimdi bu adenin, guanin, timin, sitozin denen nükleotidler aynı zamanda deoksinükleotid trifosfat olarak anılan bazlardır. bu bazlar karbonları numaralı aromatik halka içerirler.
  
  lise kimyasından hatırlanabileceği gibi, bazların hidroksil diye de bilinen oh seklinde bir kenarları olur. (buna kenar dediğim için kimya tanrıları beni çarpar mı acaba)
  
  bu oh hedesi^* bu aromatik halkanın 3 yada 5 numaralı karbonuna bağlıdır, bu sebeple 3' (üç üssü yada 'three prime' olarak okuyunuz) yada 5' (5 üssü yada ...) olarak adlandırılır.
  
  dna'yı upuzun bir zincir olarak düşünürsek, her yeni baz bir öncekinin 3' oh grubuna bağlanır demek gerekir. evet, zor kısmı atlattık.
  
  dna sıralamasını yaparken o ikili sarmal yerine tek bir zincirin de bize yeteceğini unutmayalım. çünkü purinler (guanin, adenin) ile ve primidinler (timin, sitozin, urasil) yalnızca karşılıklı bağlanırlar.
  
  evet dideoksi metodunda (ki adını da burdan alır) 3' oh bulunmayan sentetik moleküller kullanılır ve dna uzayamaz (chain termination demiştik işte bu o). dna neden uzuyor dersek onu da prosedürün tümünü anlatırken açıklayalım. misal elimize bir miktar dna aldık, bunun bazlarının nasıl sıralandığını merak ediyoruz. dnayı elimize nasıl aldık ^* dersek hemen başka bir başlığa bakmak icap eder. (bkz: dna izolasyonu) keleks ve fenol gibi değişik yöntemler vardır bu izolasyon için ama ben anlatmayayım hazır anlatılmışı ile idare edin.
  
  evet elimizdeki (tüp içinde diyelim) dnayı, tek sarmal hale getirip çoğaltmak mümkündür pek büyük bir rahatlıkla. bu tamamen sihrin rol aldığı mekanizmayı açıklamak haddimi aşar. ama yeterince bazı ve dnayı koyup, dna polimeraz nam bir enzimi de ekleyip biraz da sıcaklık ayarlayınca bu sihirli işlem kendiliğinden olmaktadır, allaha inananlar için allahın hikmeti olarak bakılabilir.
  
  bu çoğaltma işlemi dideoksi olarak bilinen 3' oh kismi olmayan sentetik bazlardan da ekleyerek yapılırsa ne olur. elimizde dna üzerindeki her baz için o baza kadar olan tüm sıradan en az bir kopya olur. şöyle demonstre edelim: (hatta şekil yapalım)
  
  bu (sol) taraf 5' tarafı olsun. 3' tarafı da sağ taraf olsun. mavi işaretli olan bazlar da sentetik dideoksi bazlarımız olsun.
  
  a
  ag
  aga
  agac
  agacg
  agacgc
  agacgct
  agacgcta
  agacgctat
  agacgctatc
  agacgctatct
  ..............
  
  öncelikle mavi bazların küçükten büyüğe doğru sıralanışının dna parçamızın kendisiyle aynı olduğuna dikkatinizi çekmek istiyorum. (gerçekte bu işlem aynı şekilde ancak tam karşılığı bazlarla yapılmaktadır fyki)
  
  evet elimizde sürüyle dna parçası var şimdi. dnamızın uzunluğunun 3.2 milyar baz olduğunu hatırlarsak neden hgp ve celera önderliğinde yürütülen insan genomunun sıralanması operasyonunun uzun sürdüğü açığa çıkabilir. biz sıralarken kafamız karışmasın diye en fazla 500 baz uzunluğunda kısımları kesip onları sıralıyoruz. hangi 500 olduğu ve bunların sıralamasının nasıl geri birleştirildiği ise shotgun method isimli başlıkta yüne bu satırların yazarınca kabaca anlatılmıştı, bunu karmaşıklık açısından uyarı olarak kabul edebilirsiniz.
  
  evet, elimizde sentetik dideoksi bazlarla biten bu sırayı nasıl ortaya çıkartacağız, nasıl kağıda dökeceğiz peki? öncelikle bu sentetik moleküllerimizi (bazlarımızı) floresans ile yahut radyoaktif olarak işaretleyecek kadar zekiyiz homo sapiens sapiens olarak. bu işaretlerin sıralanması için ise, genelde elektroforetik yöntemler kullanılır. bu durumda (bkz: elektroforez) (bkz: kapiler elektroforez)
  
  buraya kadar okumaya üşenmeyip oralara gidip okumaya üşenecek arkadaşlar için kabaca tarif etmek üzere bu karışımı bir jel matrisi içinden geçirip tarayarak sıralıyoruz dersek yanlış olmaz.
  
  (yazarın itirafı, hatırlamadığım yerleri hızlı geçtim, fermuar örneğinin daha açıklayıcı olabileceğini de fark ettim ama çok geç fark ettim, geri dönüp düzeltemem bu saatte)
• bir kisinin genetik hastalığı olup olmadığını anlamak icin yapılabilecek tüm dna dizisindeki bazların tümünü görebilmemizi sağlayan teorik olarak karışık görünen ama pratikte uygun bi laboratuarda kolayca uygulanabilecek genetik metod
• dna moleküllerinin nükleotid dizisinin belirlenmesinde halen tercihe dilen metod, zincir sonlandırma metodudur. öncelikle dna parçası, parçanın kodlayan ipliğinin tek iplikli dna olarak izolasyonuna olanak tanıyan bir faj olanm13'e klonlanır. bu daha sonra primer denen ve tek iplikli dna parçasının 3' ucuna bağlanan kısa bir dna parçasına hibridize edilir. bundan sonra deoksiribozonükleozit trifosfatlar (dntp, yani dgtp, datp, dttp, dctp) eklenir ve bir dna polimerazın, kodlayan ipliği kalıp olarak kullanarak ikinci bir ipliğin sentezini katalize etmesi sağlanır. dntp'lere ek olarak, küçük miktarlarda dideoksinükleozit trifosfatlar (ddntp) da eklenir. bir ddntp'nin eklenmesi, ikinci iplik sentezinin sonlanmasına yol açar. karşılık gelen dntp'nin ne zaman katılması gerekirse bu gerçekleşebilir. primere ek olarak 3, 6, 8, 13 veya 18 farklı nükleotidi içeren parçalar oluşturulur. bir dna dizisi elde etmek için, her biri farklı bir ddntp içeren dört ayrı reaksiyon gerçekleştirilmelidir. ürünler daha sonra sentetik bir jel tabakasına yan yana yüklenir ve elektroforez ile ayrılır. alınan yol, zincirin uzunluğu ile ters orantılıdır. dna parçaları görüntülendiğinde, nükleotid dizisi, jelde en alttan başlayıp jelin en üstüne doğru tek şeritlerde parçaların bulunuş sıralarını not ederek direkt okunabilir. optimal şartlar altında, tek bir deneyde yüzlerce nükleotidin dizisini belirlemek mümkündür.
  
  kaynak: jan koolman, klaus-heinrich röhm renkli biyokimya atlası
  dna dizisinin belirlenmesi
• (bkz: oxford nanopore) (bkz: minion/@fafi) (bkz: promethion)
• dna dizilemesinden önce ilk olarak 1792 ve 1976'da belçika'nın gent üniversitesinde walter fiers ve arkadaşları tarafından rna üzerinde çalışmalar yapılmış ve bakteriyofaj ms2 adlı virüsün tüm genome dizisi ortaya çıkarılmıştır.(bkz: rna sequencing)
  
  tam bir dna genomu ise 1977 yılında yine bir bakteriyofaj olan phi x 174 virrüsünden elde edilmiştir. en bilinen dna dizileme metodları maxam-gilbert dizilemesi ve sanger dizilemesi olsada ilerleyen teknoloji sayesinde daha hızlı ve daha uzun dna dizilerinin elde edilebildiği methodlar geliştirilmektedir.