protein elektroforezi

• oncelikle asagida okuyacaginiz aciklamanin turkce/ingilizce karisimi korkunc bir sekilde yazilmis olmasindan dolayi hicap duyuyuorum. terimlerin bir kisminin turkcesi hakkinda bilgim yok. yine de anlasilmasi icin bir kismini mantiga yakin olarak degistirdim, genel kullanimi benim yazdigimdan farkli olabilir, uyarmak icin cekinmeyiniz. degistirmedigim kisimlari ise eger cok arastirmak isteyen olursa yazdigim orijinal haliyle arasin bulsun, kendi cikarimini yapsin diye degistirmedim.
  
  protein elektroforezi, sds-page (sds-polyacrylamide gel electrophoresis) adi verilen yontemle gerceklestirilir. protein elektroforezinde proteinler yuklerine gore degil; kutlelerinin bir fonksiyonu olan, elektrik alandaki hareket kabiliyetlerine gore hareket ederler, cunku preparatin jele yuklenmesinde kullanilan solusyonun icindeki sds (sodium dodecyl sulfat, sodium lauryl sulfate), preparatta bulunan proteinlerin hepsine, kutleleriyle dogru orantili olarak bir negatif yuk verir, dolayisiyla her proteinin kutle/yuk indeksi esit olur. dolayisiyla, hepsi esit negatif yukte olan proteinler, elektroforez esnasinda, negatif anottan pozitif katoda dogru, jelde kutlelerine gore ayrilarak ilerlerler (kutlesi buyuk olan protein daha yavas, kutlesi kucuk olan protein daha hizli ilerler). prensibi anlattiktan sonra ayrintilara gecelim:
  
  1. sds-page'de analiz edilecek preparatlatin hazirlanmasi:
  preparatlar bir hucre hattindan ya da bir doku orneginden alinip hazirlanabilir. preparatta analiz edilecek unsura gore hazirlama solusyonlari degisiklik gosterir. ancak finalde, homojenize edilmis butun preparatlar, sds yukleme solusyonu (icinde preparata agirlik vermesi icin glikojen (gliserin), ph degisikliklerini karsilamasi icin tampon olarak tris-cl, preparattaki ikincil yapilari daha da iyi acmasi icin bir "reducing agent" (beta-merkaptoethanol ya da dithioerithrol (dtt)) ve preparatin jelde takibi icin bromphenol blue bulunur) eklenerek jele yuklenir.
  
  2. jelin hazirlanmasi:
  elektroforez jeli, acrylamide/bis-acrylamide karisimi bir solusyondur. bu solusyondaki acrylamide:bis-acrylamide orani ne kadar buyukse, jelin porlari o kadar kucuk demektir. laemmli prensibine gore protein elektroforezi jeli ^*, 2 jelden olusur, 1. stacking gel, 2. resolving gel. stacking jel'in ph'i 6.8 civarindadir, ve bu ph, elektroforez tampon solusyonundan 2 birim azdir, bu da molar iletkenlik prensibi sayesinde proteinlerin resolving jel'de ayrilmadan once siraya dizilmelerini saglar. resolving jel'in ise ph'i 8.8 civarindadir, bu da elektroforez tampon solusyonuyla aynidir, bu da proteinlerin bu jelde artik kutlelerine gore ayrilmalarini saglar.
  
  elektroforez jeli hazirlanirken, once resolving jel hazirlanir, ve iki cam arasina dokulur. uzerini duzlestirmek icin ve havayla baglantisini kesip polimerizasyonunu hizlandirmak icin, bir miktar isopropanol, butanol, veya su ekleyebilirsiniz. jel polimerize olduktan sonra uzerine eklediginiz seyi dokup, arayi suyla yikayip nemini aldiktan sonra, stacking jel'i hazirlayip uzerine doker, ve protein yuklenecek olan alanlari acmak icin gereken taraklari yerlestirirsiniz. polimerize olmasi icin beklersiniz.
  
  3. elektroforez tampon solusyonu:
  tris (baz), glycine, ve sds bulunur, ph'i 8.8 civarinda olmalidir.
  
  elektroforez:
  polimerize olmus jeller, kullanilan ekipmanin icine yerlestirilir, aralarina ve ekipmanin icine, jelleri kapatacak kadar elektroforez tampon solusyonu dokulur. sds yukleme solusyonu eklendikten sonra 5 dakika suresince kaynatilan preparatlar, stacking jel'deki taragin acmis oldugu bosluklara uygun miktarlarda yuklenir. ilgilenilen protein veya proteinlerin molekuler agirligini belirtmek icin daha onceden molekuler agirligi bilinen proteinlerin bulundugu hazir alinmis bir solusyon, taraklardan birine yuklenir. elektrik alani uygulanir. elektrik alani uygulandiginda, kutle/yuk indeksi esit olan proteinler, molekuler agirliklarina gore jeldeki porlarda hareket ederler. molekuler agirligi fazla olan proteinler yavas, az olan proteinler ise hizli ilerler. proteinler istenildigi gibi ayrildiktan sonra elektrik alani durdurulur.
  
  elektroforez bittikten sonra jel, gerekiyorsa boyanir veya western blotting'e devam edilir. protein elektroforezi, biyokimya ve molekuler biyoloji alanlarinda son derece yaygin olan bir tekniktir.
  
  ^* protein elektroforezinde kullanilan stok jel solusyonundaki acrylamide:bis acrylamide orani 29.5% civarindadir. protein elektroforezinde amac, ilgilenilen proteini/proteinleri iyi bir sekilde ayirmak, hatta mumkunse jelin orta bolumune denk getirmektir. ornegin ilgilendiginiz proteinin molekuler agirligi kucuk ise, yuzdesi yuksek bir resolving jel hazirlamaniz gerekir ki proteininiz koca koca porlardan fiyt diye gitmesin, kontrollu kontrollu, kucuk porlarda ilerleye ilerleye ortalara dogru gelsin. resolving jel, ilgilenilen proteinin molekuler agirligina gore %5, %10, %12, %16'lik olarak hazirlanabilir. bunun icin, resolving jeli hazirlarken ilgilenilen proteinlerin molekuler agirliklarina gore istenen yuzde oraninda stok solusyonu eklenebilir. bunun icin de 29.5%luk stok jel solusyonundan, total resolving jel hacminde dilediginiz yuzdede olacak kadar miktar almalisiniz (p1v1=p2v2 prensibi, p=percentage v=hacim).
• alakalı olarak
  
  (bkz: elektroforez)
  (bkz: western blotting)
• alakasiz olarak (cok ozur de dileyerek)
  
  (bkz: beyin amciklamasi)
  
  (bkz: viva serbest cagrisim)
• (bkz: sds-page)
  (bkz: her gün yapılan şey)